15.24. XÁC ĐỊNH CÔNG HIỆU THÀNH
PHẦN HO GÀ TOÀN TẾ BÀO TRONG VẮC XIN PHỐI HỢP, HẤP
PHỤ
Công hiệu của vắc xin
ho gà trong vắc xin DTP được xác định
bằng cách so sánh liều hữu hiệu 50% (ED50)
của vắc xin mẫu chuẩn so với vắc xin
mẫu thử. Kết quả được tính bằng
phương pháp Probit analysis (phần mềm WHO program).
Pha vắc xin
Vắc xin mẫu chuẩn
Lấy một ống vắc xin mẫu chuẩn,
hoàn nguyên bằng nước muối sinh lý vô khuẩn và tiếp
tục pha loãng tuỳ theo số đơn vị ghi trên
nhãn, dùng nước muối sinh lý pha thành ít nhất 3
độ pha loãng bậc 5 thành các
độ pha sao cho sau khi thử thách ED50 nằm
giữa 3 độ pha loãng, ví dụ theo sơ đồ
dưới đây:
A = 1/30 = 1
ống mẫu chuẩn + 30
ml NMSL
B = 1/150 = 5
ml A + 20 ml NMSL
C = 1/750 = 5
ml B + 20 ml NMSL
Vắc xin DTP
mẫu thử
A = 1/5 = 5 ml vắc xin mẫu thử + 20
ml NMSL
B = 1/ 25 = 5 ml dung dịch A + 20
ml NMSL
C = 1/125 = 5 ml dung dịch B + 20
ml NMSL
Tiêm miễn dịch
Chọn chuột nhắt trắng có
trọng lượng 14 - 18 g, nhưng các chuột trong một
thử nghiệm không được chênh lệch trọng
lượng quá 4g. Dùng chuột cùng giới, nếu khác giới
phải chia đều số chuột đực, cái vào các
nhóm và nhốt riêng.
Chuột được tiêm miễn dịch
sau khi đã được ăn uống đầy đủ
1 giờ. Tiêm ổ bụng 0,5 ml/1 chuột. Mỗi
độ pha vắc xin tiêm cho một nhóm chuột, số lượng
chuột trong mỗi nhóm tuỳ theo kết quả thẩm định
thử nghiệm nhưng không được ít hơn 20 chuột.
Tiêm miễn dịch theo thứ tự từ độ pha
loãng nhất (từ độ pha C đến A) cho cả loạt vắc xin mẫu thử
và mẫu chuẩn.
Bốn nhóm chuột đối chứng:
mỗi nhóm 10 con, được nuôi song song với nhóm
chuột miễn dịch dùng để kiểm chứng
độc lực của chủng thử thách.
Trong
thời gian miễn dịch (14 - 17 ngày), chuột phải
khoẻ và tăng trọng bình thường, ít nhất 94%
số chuột đã được MD ở mỗi
độ pha của cả vắc xin mẫu chuẩn và vắc
xin thử nghiệm phải được sống sót cho
đến ngày thử thách.
Tiêm thử thách
Sau 14 - 17 ngày miễn dịch, chuột
được thử thách với chủng B. pertussis
18323. Chủng thử thách có thể dùng chủng tươi
hoặc chủng ở dạng huyền dịch (10 tỷ
vi khuẩn ho gà) được bảo quản trong nitơ
lỏng. Chủng thử thách được pha trong dung
dịch casein 1%. LD50 của chủng thử thách
phải nằm trong khoảng 100 - 1000 vi khuẩn (vk).
Cách pha dung dịch casein 1%
Hoà tan 10 g bột casein 1% trong 1000 ml nước cất 2 lần,
cho thêm 2,3 g NaCl. Điều chỉnh đến pH 7 - 7,2 bằng
dung dịch NaOH hoặc HCl loãng. Hấp 121 0 C trong
30 phút.
Dung dịch casein 1% phải
được kiểm tra an toàn bằng cách tiêm vào não cho 5
chuột nhắt, mỗi con 0,02 ml. Theo dõi 3 ngày, toàn bộ
chuột thí nghiệm phải sống. Nếu có 1 chuột
chết phải pha lại dung dịch.
Cách pha hỗn dịch vi khuẩn để kiểm tra
liều LD50 và để thử thách
Chủng B.pertussis 18323 được
cấy truyền đời 2 hoặc đời 3 trên môi
trường Bordet - Gengou có
chứa 15% máu cừu hoặc ngựa, huyền dịch vi
khuẩn ho gà gặt từ nuôi cấy 20 – 22 giờ được
dùng để pha thành hỗn dịch thử thách hoặc sử
dụng huyền dịch vi khuẩn ho gà đậm độ
10 tỷ vi khuẩn/ml đã bảo quản trong nitrogen
lỏng để pha dung dịch thử thách. Trong khi pha
cũng như trong khi tiêm thử thách, hỗn dịch vi
khuẩn ho gà phải giữ trong đá lạnh. Thời
gian bắt đầu pha đến khi tiêm xong hỗn
dịch vi khuẩn thử thách không được quá 150
phút. Xác định đậm độ vi khuẩn ho gà bằng
mắt thường khi so với ống độ đục
chuẩn quốc tế 10 IOU hoặc đo OD bằng máy
quang phổ kế để tính số vi khuẩn ho gà trong
hỗn dịch gặt. Pha loãng huyền dich vi khuẩn ho gà
bằng casein 1% để có nồng độ là 10 x10 9
vi khuẩn /ml. (*). Nếu sử dụng chủng ho gà được
bảo quản trong nitơ lỏng thì phải làm tan băng
nhanh trước khi thử thách. Các độ pha loãng của
chủng ho gà được pha theo sơ đồ
dưới đây trong dung dịch casein 1%:
Ví dụ:
Chủng B. pertussis 18323 giữ trong nitrogen lỏng là 10. 10 9 /ml ( * ) =
A0
|
A1 |
= |
5.10 9 / ml |
= |
1 ml A0 |
+ |
1ml đệm Casein 1% |
|
A2 |
= |
5.10 9 / 2 ml |
= |
1ml A1 |
+ |
1ml đệm Casein 1% |
|
A3 |
= |
5.10 6/ 0,02 ml |
= |
1ml A2 |
+ |
9 ml đệm Casein 1% |
|
A4 |
= |
5.10.5/ 0,02 ml |
= |
1ml A3 |
+ |
9 ml đệm Casein 1% |
|
A5 |
= |
100.000/0,02 ml |
= |
3 ml A4 |
+ |
12 ml đệm Casein 1% |
|
A6 |
= |
10.000/0,02 ml |
= |
1ml A5 |
+ |
9 m Casein 1%l đệm |
|
A7 |
= |
2000/0,02 ml |
= |
1ml A6 |
+ |
4 ml đệm Casein 1% |
|
A8 |
= |
400/0,02 ml |
= |
1ml A7 |
+ |
4 ml đệm Casein 1% |
|
A9 |
= |
80/0,02 ml |
= |
1ml A8 |
+ |
4 ml đệm Casein 1% |
Tiêm
chuột
Sau 14-17 ngày, toàn bộ chuột đã
miễn dịch bởi vắc xin mẫu chuẩn và mẫu
thử được tiêm thử thách vào não, mỗi con nhận
0,02 ml hỗn dịch chứa 100.000 vi khuẩn (độ
pha A5) bằng 1 bơm tiêm bán tự động Hamilton.
Nhóm chuột đối chứng, mỗi
nhóm 10 con được tiêm với các độ pha từ
A6 – A9 tương ứng với hỗn dịch chứa
10.000 vi khuẩn ; 2000 vi khuẩn ; 400 vi khuẩn và 80 vi khuẩn .
Độ
pha hỗn dịch chứa 80 vi khuẩn sẽ được
cấy ít nhất trên 2 đĩa thạch Bordet Gengou sau khi
pha xong hỗn dịch và sau khi kết thúc tiêm thử thách.
Ủ đĩa thạch ở 35 0 C trong 3 - 4 ngày, đếm số
khuẩn lạc mọc. Thông thường số khuẩn
lạc đạt khoảng 30 %.
Cần lưu ý:
- Trong quá
trình pha và tiêm thử thách, dung dịch chủng phải luôn
giữ trong đá lạnh.
- Thời
gian tính từ khi bắt đầu pha chủng đến
khi kết thúc thử nghiệm không được quá 2,5
giờ.
- Tất
cả vật liệu chứa chủng ho gà đều
phải tiệt trùng bằng nồi hấp 121 0C/15-20
phút hoặc luộc sôi trong 30 phút trước khi rửa
dụng cụ.
-
Những chuột chết trong 3 ngày đầu sau tiêm
thử thách được coi là chuột chết không mang
tính đặc hiệu của ho gà. Do đó chỉ
những chuột chết từ ngày thứ 4 đến
ngày 14 mới được tính kết quả.
- Ngày
thứ 14 sau thử thách: Tất cả những chuột
chết, hay có dấu hiệu liệt rõ và sưng phồng
tấy đầu đều được tính là
chuột chết.
Tính kết quả
Dựa vào số chuột sống sót trong
mỗi nhóm chứng, dùng phương pháp Reed Muench
để tính LD50
của chủng thử thách.
Xem ví dụ dưới đây:
|
Số Vi khuẩn |
Số Chuột |
Số Sống |
Số Chết |
Số tích lũy |
Tổng số |
% chết |
|
|
Sống |
Chết |
||||||
|
10 000 2 000(B) 400(A) 80 |
10 10 10 10 |
1 3 6 8 |
9 7 4 2 |
1 4 10 8 |
22 13 6 2 |
23 17 16 20 |
95 76(b) 37(a) 10 |
Theo thí dụ trên, LD50 nằm trong
khoảng giữa 2 liều 2000 và 400 vi khuẩn, số %
chuột chết tương ứng với liều sát trên
50% là 76%, số % chuột chết tương ứng
liều sát dưới 50% là 37%
Tính LD50 theo công thức sau :
50 - a
Log LD 50 = Log A [ -------- ] x Log 5
b
- a
Trong đó:
A : Liều gây
chết vừa sát dưới 50% ( trong thí dụ trên là 400 )
a :% chết tương ứng với A (
trong thí dụ trên là 37% )
B - Liều gây chết vừa sát trên 50% (
trong thí dụ trên là 2000)
b :% chết tương ứng với B (
trong thí dụ trên là 76% )
Thay bằng con số cụ thể là:
50 - 37
Log LD 50 = Log 400 [ ------------ ] x log 5
76 - 37
LD50 = 680 vi khuẩn
Dùng
phương pháp Probit analysis của chương trình phần
mềm WHO program để tính công hiệu của vắc
xin ho gà.
Thử nghiệm được coi là có giá trị khi:
- ED50
của vắc xin chuẩn và ED50 vắc xin thử
nghiệm nằm giữa độ pha loãng nhất và
độ pha đặc nhất của các vắc xin
đó.
- Trong
suốt thời gian miễn dịch cho đến ngày
thử thách số chuột trong mỗi độ pha không
được chết quá 6%.
- Liều
thử thách phải chứa 100 – 1000 LD50, như
vậy liều LD50 phải chứa 100 - 1000 vi
khuẩn.
- Thử
nghiệm phải đạt đựơc tiêu chuẩn
của chương trình Probit Analysis đặt ra về đường thẳng và
đường song song của mối tương quan
đáp ứng liều.
Nếu kết quả công hiệu thành phần
ho gà trong vắc xin DTP hấp phụ không đạt yêu cầu, thử nghiệm phải
được nhắc lại:
- Nếu
lần 1 không đạt yêu cầu công hiệu và thử
nghiệm không có giá trị (invalid test) thì chỉ cần
nhắc lại thử nghiệm với số lượng
mẫu bằng lần 1. Kết quả lần thử
nghiệm nhắc lại nếu đạt yêu cầu thì
loạt vắc xin đó được coi như đạt
công hiệu thành phần ho gà. Nếu kết quả không đạt
yêu cầu thì loạt vắc xin đó phải bị
huỷ bỏ.
- Nếu
thử nghiệm lần 1 không đạt yêu cầu nhưng
thử nghiệm có giá trị (valid test) thì phải nhắc
lại thử nghiệm với số lượng mẫu
gấp đôi. Trong trường hợp này loạt
vắc-xin chỉ đạt được yêu cầu
về công hiệu khi kết quả trung bình nhân của
tất cả các thí nghiệm công hiệu có giá trị không
thấp hơn tiêu chuẩn cho phép.
Tiêu chuẩn chấp thuận
Vắc xin đạt yêu cầu nếu công
hiệu không ít hơn 4 IU trong 1 liều đơn vắc
xin cho người và giới hạn dưới của 95 %
khoảng tin cậy của công hiệu tìm được
không ít hơn 2 IU trong 1 liều đơn vắc xin cho
người.